По преданию, монастырь располагается на том месте, где произошла встреча князя Игоря Святославича и его брата Всеволода перед их походом на половцев в 1185 году.

 Судя по технике строительства пещер предположительно монастырь был основан в XIV веке монахами Киево-Печерской Лавры. Холков-Царев-Николаевский мужской монастырь впервые упоминается в 1620 году. Его настоятель в то время — инок Геласий. В 1650—1700 годах построен подземный Троицкий храм. Его купол был выложен из кирпича.

В 1653 году царь Алексей Михайлович дал настоятелю монастыря Ефрему жалованную грамоту на безоброчное владение мельницей, которую монахи построили рядом недалеко от пещер на берегу речки Холки. В 1757 году была возведена деревянная часовня перед входом в пещеру. Вскоре она была расширена и стала служить надвратной церковью. Поскольку монастырь регулярно подвергался набегам татар, в 1666 на самом высоком холме неподалёку от монастыря была сооружена «Жестовая сторожка» для наблюдения за степью, которая входила в систему белгородской засечной черты.

В 1764 году согласно указу Екатерины Второй о секуляризации пещерный Холковский монастырь был упразднен.

В 1830-х годах князь А. Б. Голицын попытался на свои средства возобновить пещеры и пещерную церковь, однако по разным причинам подземный монастырь так и не открылся. В XIX веке службы для прихожан проводилась в наземном Преображенском храме, а нижняя пещерная церковь была заброшена.

К XIX веку относится описание Холковских пещер (в «Памятной книжке Курской губернии на 1888 год» и «Календаре и памятной книжке Курской губернии на 1892 год»). Там сказано, что общая площадь пещер — 255 кв. м, церкви — 60 кв. м, келий — 172 кв. м, длина коридора — около 126 метров. В начале XX века вход в пещеры был засыпан и практически забыт.

В 1909—1915 году настоятель Преображенской церкви отец Вячеслав выяснил, что некогда на этом месте существовал подземный монастырь. Под его руководством местные крестьяне и наёмные рабочие откопали древние пещеры с келями и подземной церковью и возвели перед входом часовню.
Одновременно неподалёку появилась и другая пещера (т. н. «пещера старца Никиты»), вырытая в 1890—1920 отшельником Никитой — уроженцем села Холки.

В советское время пещеры были закрыты. Подземные достопримечательности открылись для посетителей лишь в 1990 году. Богослужения в подземном храме возобновлены в 1995 году. В 1997 году заложены храмовые строения будущего монастыря — надвратный Храм преподобных Антония и Феодосия Киево-Печерских, Владимирская часовня на холме и Храм Донской иконы Божьей Матери. В 1999 году монастырь был открыт.