Собор был построен в 1479 году по указу великого князя московского Ивана III итальянским архитектором Аристотелем Фиораванти. Внутри собор разделён шестью столпами (2 квадратных на востоке и 4 круглых в наосе) на 12 равных ячеек, перекрытых крестовыми сводами. Смещение куполов к алтарной части и равный диаметр проёмов барабанов подчёркивают симметрию интерьера. В алтарной части устроены три придела: Петропавловский (с севера), Дмитровский (с юга) и придел Похвалы Богоматери (на своде ризницы, под юго-восточным куполом).

Входя в собор, внимание посетителя привлекает соборный пятиярусный иконостас, высота которого составляет более 16 метров. Ему предшествовал меньший по размерам (9,5 м), созданный Дионисием и его помощниками в 1481 году. Новый иконостас был заказан патриархом Никон вскоре после своего избрания на патриарший престол. Нынешний ансамбль, созданный всего за десять месяцев – с марта 1653 года по январь 1654 года, включает в себя 69 икон. Они были написаны большой артелью «кормовых иконописцев» из разных городов – Ярославля, Костромы, Осташкова. Иконостас Успенского собора был украшен серебряным золоченым окладом, однако он не сохранился до наших дней. Во Отечественной войны 1812 года он был похищен противником и воссоздан вновь по уцелевшим фрагментам при реставрации иконостаса в 1813 и 1882 годах. Иконы были промыты и вновь прописаны и покрыты олифой в 1852 году академиком живописи Н.И. Подключниковым.

При возведении собора для его росписи были приглашены лучшие российские живописцы. В 1481 году, после освящения нового храма, духовник великого князя ростовский архиепископ Вассиан «дал сто рублев мастерам иконникам, Денисию, да попу Тимофею, да Ярцу, да Коне» писать в Успенский собор иконостас. Вероятно, эта же артель мастеров во главе с Дионисием в конце XV-начале XVI века расписала в технике фрески алтарную преграду собора, и его алтарные помещения. Частично эти самые древние фрески Москвы дошли до наших дней.

В 1513-1515 годах по указу великого князя московского Василия III храм был расписан целиком. К сожалению, пожар 1626 года сильно повредил все фрески. В 1642 году царь Михаил Федорович указал расписать Успенский собор стенным письмом заново. Для выполнения этой работы было призвано около 150 живописцев. Возглавили эту артель художников царские изографы Иван и Борис Паисеины, Сидор Поспеев, Бажен Савин, Марк Матвеев, Степан Ефимьев. Согласно царскому указу, живописцы должны были повторить состав и расположение росписей 1515 года, для чего Иван Паисеин и его помощники сняли с них на бумагу контурные переводы и только после этого сбили старую штукатурку со стен и нанесли новый левкас. В основном работа по украшению живописью интерьера Успенского собора была завершена в 1643 году. В общей сложности было написано 249 сюжетных композиций и 2066 отдельных фигур, на позолоту фона был потрачен 1721 золотой червонец.

Посвящение московского кафедрального храма главному богородичному празднику - Успению Богородицы, обусловлено особым почитанием на Руси Богоматери. Помимо проведения обрядов венчания на царство и коронации, в Успенском соборе также возводили в сан епископов, митрополитов и патриархов, оглашали государственные акты, служили молебны перед военными походами и в честь побед.

Проводились и другие действа. В частности, у гроба митрополита и чудотворца Петра, а также перед главной русской святыней – иконой Владимирской Богоматери – удельные князья и «все чины» присягали на верность великому московскому князю, а впоследствии царю.

В Успенском соборе происходило освящение елея и мира – благовонных масел, использовавшихся в священных таинствах при соборовании умирающих, крещении, рукоположении священников, а также миропомазании царя при его венчании на царство.

Ежегодно 17 декабря в Успенском соборе совершалось театрализованное представление «Чина пещного действа» в память о трех вавилонских отроках Анании, Азарии и Мисаиле. Кроме того, проводился «чин православия», то есть возглашение анафемы отступникам, еретикам и государственным изменникам и поминание «ревнителей христианского благочестия».

В четверг на Страстной неделе совершался чин омовения ног, когда патриарх по образу Христа, омывшего в знак смирения и братской любви ноги апостолам, возливал воду из особой лохани на правую ногу двенадцати архимандритам – главам монастырей.

В Соборе проводились бракосочетания, которые имели государственное значение. Так, в 1391 году митрополит Киприан обвенчал великого князя Василия Дмитриевича с литовской княжной Софьей Витовтовной. В 1472 году состоялось торжественное бракосочетание Ивана III и Софьи Палеолог, в 1505 году Василий III обвенчался с Соломонией Сабуровой, а в 1526 году, вторично, с Еленой Глинской, матерью Ивана Грозного. 8 марта 1606 года, в период Смуты и польско-литовской интервенции, в Успенском соборе были обвенчаны Лжедмитрий с Мариной Мнишек. В 1721 году здесь происходило венчание Петра I с Екатериной I и одновременно ее коронация.

В XIV – XVII веках Успенский собор являлся усыпальницей глав русской церкви – митрополитов и патриархов. Здесь находятся 19 захоронений митрополитов и патриархов и гробницы с мощами московских святителей Петра, Ионы, Филиппа и Гермогена