Абстракт: Вирусы гриппа А – зоонозные патогены, которые продолжительно циркулируют и изменяются в некоторых животных-носителях, включая птиц, свиней, лошадей и людей. Имеет высокую вероятность появление новых штаммов вируса, способных стать причиной эпидемий или пандемий у человека. Здесь мы обсудим значение наблюдения и характеристики природного вируса гриппа и рассмотрим вопрос о влиянии новых лабораторных разработок, направленных на понимание нами тропности хозяина и вирулентности вируса. Мы так же пересмотрим уроки, извлеченные из вирусных пандемий за последние 100 лет.

Вирусы гриппа А постоянно циркулируют во многих животных-носителях, таких как люди, птицы, лошади, собаки и свиньи. Сезонные вирусные инфекции гриппа у людей вызывают ежегодные эпидемии,  результатом которых является заражение миллионов людей во всем мире и которые важны для бремени болезней и экономического бремени. Пандемии гриппа так же могут иметь истребляющий эффект на глобальном уровне, приводя к многочисленным смертям. Вирус гриппа А имеет сегментированный геном – восемь одноцепочечных молекул РНК, которые как правило кодируют 11 или 12 вирусных белков, включая N40, недавно идентифицированный белок, который экспрессируется сегментом РВ1 (рис. 1а). Хорошо известно, что одновременное инфицирование одной клетки двумя различными вирусами гриппа А может привести к смешению генов или рекомбинации, которая может стать результатом образования нового штамма вируса гриппа и считается, что большинство вирусных пандемий человека возникло в этой манере.

Вирусы гриппа А разделяются на подтипы в соответствии с антигенными характеристиками их гликопротеинов – гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА). ГА играет важную роль в определении тропности хозяина, связываясь с рецепторами клеток носителя, которые содержат компоненты терминально α‑2,6-сцепленных или α‑2,3-сцепленных сиаловых кислот (α‑2,6‑SA или α‑2,3‑SA). Он так же содержит участок рестрикции, который может расщеплять протеазы клеток хозяина. Аминокислотная последовательность этого участка рестрикции модулирует тканевой тропизм и системное распространение, воздействуя на тяжесть заболевания (обсуждается ниже). Активность нейраминидазы имеет решающее значение, для разрушения SA-содержащих рецепторов хозяина и вирусной мембраны, процесса, который требуется для правильного почкования и отделения дочерних вирионов с поверхности клетки хозяина. В настоящее время штаммы вируса образованные 16 подтипами ГА и девятью подтипами НА циркулируют в птицах, и штаммы двух подтипов вируса циркулируют в людях: H1N1 и H3N2 (штаммы H2N2 так же циркулировали в людях с 1957 по 1968). В целом, подтипы ГА делятся на две группы (или линии) на основании их антигенных свойств и основных структурных особенностей (рис. 1б). Группа 1 заключает в себе филогенетические ветви H1a, H1b и H9, которые включают подтип Н1, содержащийся в обоих пандемических штаммах H1N1 1918 и 2009 гг и сезонных штаммах H1N1 человека, и подтип ГА H5, который содержат высоко патогенные штаммы птичьего гриппа (HPAI) H5N1. Группа 2 состоит из филогенетических ветвей Н3 и Н7, которые содержат штаммы H3N2 человека и HPAI H7N7 соответственно (рис. 1б). Антигенная эволюция сезонных вирусов гриппа А человека происходит посредством антигенного дрейфа и характеризуется сезонной селекцией новых штаммов, ГА и НА которых содержат аминокислотные замены. Эти изменения частично преодолевают ранее существовавший иммунитет человека и главным образом эти новые штаммы содействуют сезонным эпидемиям гриппа. Более выраженные изменения в подтипе ГА, обусловленные антигенной изменчивостью, традиционно связывались с появлением пандемических вирусов, хотя эту точку зрения оспаривает пандемия H1N1 2009 года (обсуждается ниже). Таким образом ГА не только играет важную роль в жизненном цикле вируса гриппа (рис 1с), но также, через изменения в его генотипе, является определяющим фактором восприимчивости хозяина и патогенеза.

Зоонозный источник пандемий гриппа человека хорошо описан и привлекает внимание общественности увеличением числа летальных исходов у людей инфицированных вирусами HPAI H5N1, которые распространены в домашних птицах на всем протяжении Восточной и Юго-Восточной Азии, Ближнем Востоке, Африке и Европе. К счастью, эти антигенно новые вирусы до сих пор не поддерживают передачу от человека к человеку и потому не в состоянии привести к потенциально гибельной пандемии. Напротив, сюрпризом для сообщества исследователей вируса гриппа стал новый, происходящий от свиней вирус гриппа H1N1 (SOIV), который возник в 2009 году и привел к первой пандемии гриппа человека в двадцать первом веке. В течение 1 года, этот вирус распространился на 214 стран и стал причиной> 18000 подтвержденных смертей по всему миру. Считается, что к апрелю 2010 года, в одних только Соединенных Штатах от 43 млн до 89 млн человек были инфицированы этим вирусом.

В связи с распространением в 2009 году пандемического H1N1 SOIV, с целью охарактеризовать геномную последовательность и патогенность и исследовать способность к передаче, антигенные характеристики и чувствительность к противовирусным препаратам были незамедлительно развернуты современные системы наблюдения, а также недавно созданные экспериментальные инструменты и модели на животных. Выдающаяся совместная работа множества лабораторий во всем мире послужила гарантией того, что пандемия была преодолена как можно быстрее. В течение этого периода был отмечен несомненный прогресс в различных областях современных исследований вируса гриппа, который значительно улучшил нашу компетенцию в быстроте реагирования. Тем не менее, так же было очевидно, что пандемия застала мир врасплох и что специфические аспекты плана действий по готовности к пандемии все еще нуждаются в улучшениях. В обзоре обсуждаются последние достижения и будущие потребности в полном и систематическом наблюдении животных и человека, уточнении оценки вирулентности новых штаммов для людей и улучшения понимания вирусной тропности, которые лежат в основе механизмов патогенеза.

Штаммы гриппа А двадцать первого века

Пандемический потенциал вируса HPAI H5N1, как и многочисленные вспышки, вызванные подтипами вирусов Н5, Н7 и Н9 у диких птиц, послужили толчком к наблюдениям за вирусами гриппа птичьих видов в различных регионах по всему миру. Тем не менее, появление пандемического H1N1 от свиней в 2009 году пролило свет на недостаток систематического наблюдения за другими восприимчивыми хозяевами. Широкомасштабное усиленное наблюдение способствовало разработке ряда ключевых технологий, в том числе технических средств с высокой пропускной способностью и глубоко-секвенирующих (которые использовались для получения полных последовательностей вирусного генома из полевых и клинических изолятов), баз данных выделенных последовательностей и филогенетических усложнений и инструментов коалесцентных анализов. Эти инструменты делают возможными быстрые, более полные эпидемиологические исследования вирусов гриппа в человеке и натуральных резервуарах.

Наблюдение за птичьими вирусами

Вирусы HPAI H5N1 вероятно возникли в результате мутаций участка рестрикции ГА, путем внедрения низко патогенного птичьего вируса H5N1 от диких птиц к домашним птицам. Несколько крупных вспышек вирусов HPAI H5N1 происходили у домашних птиц, а первый случай инфицирования человека HPAI H5N1 был задокументирован в 1997 году. В целом, до сведения ВОЗ были доведены 562 случая заболевания людей из разных стран со смертельным исходом ~59% (329 смертей), и, на сегодняшний день, большинство случаев были ассоциированы с непосредственным контактом человека с инфицированными видами птиц. Наблюдение за дикими птицами – ключ к пониманию происхождения, патогенеза, эволюции и распространенности этих вирусов в мире. Начиная с 2002 года, генотип Z (который содержит небольшие делеции в генах, кодирующих белки НА и NS1) был преобладающим генотипом H5N1 в южной части Китая. Тем не менее, на сегодняшний день, были идентифицированы десять различных, хорошо развитых филогенетических ветвей вируса HPAI H5N1, что наглядно показывает комплексную и динамическую эволюцию этих вирусов в природе. Комплексные геномные исследования разнообразной выборки вирусов птичьего гриппа продемонстрировали наибольшую изменчивость в белках ГА, НА и NS1, и привели к открытию предполагаемого доменного лиганда PDZ карбоксильного конца NS1, который может быть замешан в вирулентности. Наблюдение за дикими птицами Северной Америки показало, что штаммы Евразии и Америки редко смешиваются, и не обнаружило никаких свидетельств вирусов HPAI H5N1. Тем не менее, изоляты AIV из США продемонстрировали высокий уровень степени рекомбинаций среди циркулирующих штаммов, хотя не было найдено совершенного соответствия характерных участков среди сегментов РНК (то есть, видимо, для пар или групп рекомбинирующихся сегментов не существует никаких требований). Это скорее наводит на мысль о постоянном смешении геномов AIV, чем о постоянном распространении ограниченного и стабильного набора сегментов, которые характеризуют адаптацию млекопитающих к вирусам гриппа А.

В 2005 году вирус HPAI H5N1 был ответственен за вспышку среди водоплавающих птиц на озере Цинхай, на западе Китая, результатом чего стала высокая смертность птиц и повышение обеспокоенности возможностью непрерывной передачи вирусов HPAI H5N1 среди перелетных птиц. В последствии, генетически и антигенно различные филогенетические ветви HPAI H5N1 появились на протяжении широкого географического ареала в Юго-Восточной Азии и стали эндемичными у домашних птиц. Совсем недавно, приводя к селекции вирусов, способных инфицировать множество птиц переносчиков и обеспечивая возможность трансмиссии в другие географические регионы,в результате рекомбинации с эндемичными вирусами, которые присутствуют у местных водоплавающих птиц, возникли вирусные линии HPAI H5N1. Оба транспорта, от домашних и мигрирующих птиц, кажется, играют важную роль в распространении вирусов HPAI H5N1 на дальние дистанции и, возможно, объясняют вспышки в Европе, на ближнем Востоке и в Африке. Тем не менее, отсутствие дальнейшей рекомбинации этих вирусов после их экспорта из Китая указывает, что различные факторы, влияющие на эпидемиологию AIV могут существовать в других областях мира.

В дополнение к вызванным вирусами HPAI H5N1 вспышкам у диких птиц и болезни человека, в последние два десятилетия наблюдались вспышки у домашних птиц, а также зоонозное инфицирование людей вирусами подтипов Н7 и Н9 в Европе, Азии и Америке. Эти вспышки мотивировали усилить наблюдения, чтобы лучше понять экологию, геномные характеристики и глобальную циркуляцию этих и других AIV. Широкомасштабные филогенетические анализы вирусов H9N2 выявили явные географические и хозяин-специфические паттерны, которые отражают сложную эволюцию этих вирусов. В южном Китае, долгосрочное становление множества линий AIV, таких как линии H9N2 и H5N1, как полагают, способствует высокому уровню рекомбинаций наблюдаемых в этом регионе, таким образом, приводя к возникновению большого генетического разнообразия этих вирусов. Интересно, что у вирусов AIV и HPAI H5N1, являющихся изолятами человеческих вирусов эндемичных в Китае, которые изучались в течение 2007 и, видимо, на протяжении 13 лет подвергались положительной селекции, но не подвергались рекомбинации, были найдены гены, аналогичные генам, кодирующим внутренние белки вирусов H9N2 (PB2, PB1, PA, NP, M и NS). Обширные сегментарные рекомбинации также наблюдались у вирусов Н7, которые имеют несколько подтипов НА, что связывались и оказывали поддержку специфическим белкам Н7 – ГА, на протяжении различных географических регионов (к примеру, вирусы Н7 в Австралии образуют монофилетическую ветвь, основанную на их белке ГА, который может сочетаться с подтипами N2, N3, N4, N6 и N7). Последние вирусы Н7, которые были изолированы в результате наблюдения за дикими птицами в Европе были тесно связаны с вирусами Н7, которые вызвали вспышку среди домашней птицы в Италии (1999-2000) и Нидерландах (2003), что подчеркивает значение систематического усиленного наблюдения направленного на обнаружение птичьих вирусов, потенциально опасных для человека.

Молекулярная эпидемиология сезонных вирусов

Сезонные вирусы H1N1 и H2N3 распространяются среди людей с 1977 года. Несмотря на то, что оба этих подтипа имеют различную эволюционную динамику, при более медленном дрейфе подтипа H1N1, они все часто подвергаются рекомбинации линий, связывающей их в подтипы. Таким образом, многочисленные линии распространяются совместно, и случайные внутрилиниевые рекомбинации вносят вклад в развитие общего вирусного генетического пула сезона.Масштабный анализ последовательностей вирусов H1N1 и H3N2 привели к созданию модели «sink-source», объясняющей происхождения ежегодных сезонных вспышек. Согласно этой модели популяция тропиков подвергается сильной антигенной селекции и служит «источником» эпидемий вируса гриппа таким образом, что вирусы переносятся линейно из этого источника в «sink»-популяции в Северном и Южном полушариях. Строго однонаправленная суть глобальных эпидемий также была показана при генетическом и антигенном анализе сезонных вирусов H3N2 2002-2007 годов. Это исследование показало, что географически перекрывающиеся эпидемии в Восточной и Юго-восточной Азии создают продолжительное распространение вирусов influenza H3N2 в пределах этого региона, из которого затем вирусы переносятся (посредством путешествий и торговых путей) в Океанию, Северную Америку, Европу и, в дальнейшем, Южную Америку.

Следовательно, пристальное наблюдение (строгий надзор) за вирусом гриппа в Восточной и Юго-восточной Азии могут помочь определить антигенные характеристики вирусов, которые в дальнейшем могут циркулировать в других частях мира. В связи с полученными данными, появление вирусов гриппа, которые вызывают сезонные эпидемии, во многом находятся под влиянием глобальной миграции вирусов и не являются результатом скрытого нахождения вирусов гриппа в организме хозяина, реактивированных во время зимы. Сухость, холод, зимние условия способствуют эффективной передаче и распространению вирусов гриппа. Однако, пандемия вируса H1N1 в 2009, образовавшаяся во время весны в Северном Полушарии, распространялась в течение лета и произвела большую повторную волну инфекций, чем пик прошлой осени, показывающую, что не смотря на климатические условия, влияющие на эпидемиологию вируса гриппа А, его передача и распространение может эффективно происходить в простых районах, независимо от сезонности, и что это распространение может быть смодулированно другими факторами, такими как тесные контакты восприимчивого населения.

Появление пандемического вируса гриппа H1N1 в 2009 году

Несмотря на повышенное сосредоточение на контроле вирусов HPAI H5N1 в Юго-Восточной Азии, появление в апреле 2009 пандемии H1N1 SOIV стало в значительной степени неожиданным. К счастью, несколько лет скоординированных международных мер, направленных на предотвращение возможной пандемии H5N1 сделали возможным быстрое обнаружение и непрерывный надзор за новым пандемическим штаммом H1N1 который распространился по всему миру (BOX 1). Беспрецедентные меры, использующие современные эпидемиологические и молекулярные инструменты, позволяют быстро охарактеризовать скорость передачи человеку и определить потенциальную патогенность, последовательность оснований и происхождение нового вируса H1N1. Тем не менее, точность и значение оценки патогенеза раннего течения пандемии остается спорным вопросом. К примеру, ограниченные эпидемиологические данные, которые были доступны в начале вспышки в Мексике, привели к переоценке степени тяжести нового пандемического вируса. Тем не менее, ранние генетические и эволюционные анализы выявили, что этот вирус содержит сложный набор генов, которые берут начало от вирусов, заражающих птиц, людей и свиней (Рис. 2), и что они, скорее всего, происходят от вирусов, циркулировавших в популяции свиней и не обнаруживавшихся, приблизительно, в течении десятилетия. Поэтому, появление пандемического вируса гриппа H1N1 в 2009 году подчеркнуло важность наблюдения за животными и людьми, в понимании, ответном реагировании и повторном возникновении патогенов.

Новые концепции в тропности хозяина.

Большинство подтипов вируса гриппа ограничивается определенными хозяевами, но некоторые производят впечатление более неразборчивых и циркулируют в нескольких видах (к примеру, вирусы H1N1 и H3N2 являются эндемичными для человека, птиц и свиней). С 1918 года подтипы H1N1, H2N2 и H3N2 положили начало пандемиям гриппа у людей. Тот факт, что наблюдались только спорадические инфекции (у людей, которые находились в непосредственном контакте с видами птиц, инфицированных вирусами HPAI H5N1) особенно подчеркивает представление о том, что факторы хозяина ограничивают инфицирование вирусом гриппа новых видов (см. Обзор 51).  Тем не менее, пандемия H1N1 2009 года и предыдущие пандемии напоминают, что некоторые вирусы могут без труда обходить ограничительные барьеры хозяина.

Тканевой тропизм и рецепторная специфичность

Белки ГА сезонных подтипов Н1 и Н3 вируса человека  в основном распознают рецепторы с концевыми фрагментами α‑2,6—SA, которые находятся на бронхиальных эпителиальных клетках верхних дыхательных путей (ВДП) человека. В отличие от этого, AIV связываются преимущественно с галактозой, сопряженной с α‑2,3—SA, которые находятся в изобилии на эпителиальных клетках в кишечнике птиц и в нижних дыхательных путях (НДП) людей (Рис. 3). Свиньи имеют рецепторы в трахее, содержащие как α‑2,3—SA, так и α‑2,6—SA и, по этой причине, были представлены, как «смесительный сосуд» (см. обзор 57) для рекомбинации человеческого и птичьего вирусов, приводящей к возможному порождению пандемических вирусов. Точно так же, фазаны, индейки, перепела и цесарки имеют оба типа рецепторов в дыхательных путях и кишечнике, и могут так же служить «смесительными сосудами». Интересно, что были опубликованы данные о том, что H1N1 SOIV, ответственный за пандемию в 2009, может связываться с α‑2,6—SA и, в ограниченной степени, с α‑2,3—SA и инфицировать клетки ВДП и НДП. Фиксация на НДП, предположительно, индуцирует вирусную пневмонию, которая наблюдается у лиц, инфицированных вирусами HPAI и происходила в некоторых тяжелых случаях во время пандемии 2009 года. Вместе с тем, вирусы HPAI H5N1 могут так же инфицировать и реплицироваться в клетках эпителия носоглотки и ротоглотки и, таким образом, использовать другие рецепторы для заражения клеток ВДП. Птичьи вирусы специфичны для рецепторов, содержащих α‑2,3—SA, которые большей частью представлены у человека в ВДП, что, вероятно, способствует ограниченной вирусной трансмиссии от птицы к человеку, хотя обмен поверхностных гликопротеинов вируса HPAI H5N1, в том числе с ВДП, не обеспечивает контагиозность способного к передаче сезонного вируса. Таким образом, в дополнение к ГА-рецепторной специфичности, другие вирусные факторы, факторы хозяина и окружающей среды, вероятно влияют на приспособляемость и передачу вирусов гриппа у различных хозяев.

Тем не менее, специфичность и аффинность ГА для этих рецепторов – это один из решающих факторов тропизма хозяина и передачи (Рис. 3). К примеру, передача по воздуху вируса гриппа H1N1 пандемического в 1918 году в модели хорька модулируется аминокислотами в ГА в положениях 190 и 225 (для стандартизации используется нумерация Н3). Варианты D225G снижают аффинность α‑2,3 связанных SA, в результате чего ослабляется фиксация на бокаловидных клетках человеческой трахеи (которые экспрессируют α‑2,6 содержащие рецепторы) и снижается передача у хорьков. Вариант D225G в комбинации с измененным D190E, которым подходят согласованные аминокислоты, находящиеся у птичьих штаммов H1N1, приводит к предпочтительной фиксации на рецепторах, содержащих α‑2,3—SA. Хотя этот вирус может эффективно реплицироваться в ВДП хорька, его контагиозность это аннулирует. Продуктивная передача вирусов HPAI H5N1 от человека к человеку не происходит успешно в природе или в экспериментальных моделях передачи на млекопитающих. Таким образом, для успешного заражения и передачи может понадобиться специфическая адаптация. Мутации G225D и E190D снижают авидность вируса HPAI H5N1 к α‑2,3—SA, но специфичность к α‑2,6—SA не пользуется преимуществом, указывая, что различные аминокислотные остатки ответственны за рецептор-связывающую специфичность вирусов H5N1 (рис. 3, таблица 1). Кроме того, различные остатки, расположенные вокруг рецептор-связывающего сайта, причастны к рецептор-связывающим особенностям других птичьих и пандемических вирусов (таблица 1), что указывает на дифференциальное модулирование рецепторной специфичности в различных подтипах ГА. Важно отметить, что изоляты вирусов H1N1 SOIV которые были найдены во время пандемии 2009 года, содержали мутации D225G ассоциированные с тяжелой болезнью человека и смертью. Эти изоляты проявляют повышенную связь с α‑2,3—SA, так что эта мутация дарует двойную рецепторную специфичность. Способность H1N1 SOIV, ответственного за пандемию 2009 года, частично связываться с α‑2,3—SA контрастирует с сезонными вирусами H1N1 человека, которые существовали ранее 2009 года и которые связывают преимущественно α‑2,6—SA и, возможно, отражают годы адаптации человека. Интересно, что эти вирусы человека имеют более высокую аффинность для длинных, чем для коротких сахаров, содержащих α‑2,6—СА, предполагается, что топология гликана так же может модулировать аффинность связывания с ГА и адаптацию вирусных рецепторов. Небольшие различия в рецепторной специфичности пандемического штамма 2009 года могут частично объяснить повышенную репликацию, передачу и патогенез, которые наблюдались на животных моделях для этого вируса в сравнении с сезонными вирусами. Следует отметить, что тяжесть заболевания, индуцируемого пандемическим в 2009 году вирусом H1N1 в общей человеческой популяции не резко отличалась от наблюдаемой во время сезонного гриппа, предполагается, что дополнительные факторы, такие как ранее существовавший иммунитет и адаптация хозяина (обсуждается ниже), модулируют патогенный потенциал вирусов гриппа А у людей.

Компетентность репликации

Афинность рецепторов не гарантирует успешное заражение и репликацию в хозяине, а общая вирусная приспособляемость имеет решающее значение, для роста вируса гриппа. Вирусная полимераза дарит хозяин-специфическую адаптацию, которая повышает эффективность репликации. Остаток K627 РНК-зависимой РНК-полимеразы белка РВ2 уже давно признан как определяющий круг хозяев, придающий способность заражать людей и присутствующий в большинстве человеческих вирусов H1N1 и H3N2, но в немногих птичьих вирусах. Вирусы, содержащие остаток К627 могут расти при температуре 33С и эффективно реплицироваться в ВДП мышей, указывая, что они могут легко реплицироваться в ВДП людей (рис 3). К627 коррелирует с повышенной вирулентностью изолятов человеческого HPAI H5N1 и был найден в смертельном случае инфицирования человека вирусом HPAI H7N7 во время вспышки в Нидерландах в 2003. Вирусы, которые были изолированы от птиц во время вспышки на озере Цинхай в Китае так же обладали замещенным К627, это указывает что данный остаток может эволюционировать в природе без предварительной селекции в людях. Мутация D701N в РВ2 так же была вовлечена в адаптацию AIV к росту в клетках млекопитающих и вариабельность передачи была показано в моделях на морских свинках и хорьках. Удивительно, но пандемический штамм H1N1 2009 года может эффективно реплицироваться и передаваться, и даже может вытеснять сезонные, адаптированные к человеку штаммы, не смотря на то, что его РВ2 не имеет адаптаций ни К627, ни N701. Недавно было установлено, что остаток R591, который присутствует в пандемическом штамме 2009 года, может обеспечивать эффективную репликацию у млекопитающих и компенсирует отсутствие адаптаций K627 и N701. Другие недавние исследования показали, что ГА, НА, РВ2 и РА (другой белок РНК-зависимой РНК-полимеразы) способствуют компетентной репликации вирусов H7N7 в клетках человека. Точно так же, человек-адаптирующие белки РВ2 и ГА в моделях на хорьках были найдены как обеспечивающие компетентность репликации и контагиозность некоторым AIV. Таким образом, адаптации в белках полимеразы и ГА обеспечивает успешную фиксацию вируса, внедрение и репликацию в соответствующих клетках дыхательных путей человека.

Факторы хозяина, которые влияют на заражение вирусом гриппа

Последние полногеномные методики определили различные факторы хозяина, которые необходимы для эффективной репликации вируса гриппа (см. обзор 98). Они включают в себя факторы хозяина, которые участвуют во встраивании и сбрасывании оболочки вируса; транспорт комплексов вирусного РНП в ядро; репликацию, транскрипцию и трансляцию вирусного генома; экспорт комплексов вирусного РНП из ядра, а, так же, сборку и размножение вируса. Некоторые из необходимых факторов хозяина, существенно снижают интенсивность вирусной инфекции. Например, вакуолярная АТФаза ATP6V0D1, которая участвует в пути эндоцитоза, необходима для встраивания вируса гриппа, и малое интерферирующее РНК-опосредованное истощение мРНК ATP6V0D1 в клетках человека НЕК-294 специфически снижает репликацию вирусов H1N1 и H5N1. Другими найденными белками, которые требуются для оптимальной репликации вируса гриппа А были: CAMK2B – рецептор к кальцию, который повсеместно экспрессируется и участвует в регуляции некоторых клеточных процессов; CLK1 который участвует в регуляции альтернативного сплайсинга в клетках млекопитающих; и р27 (также известный как CDKN1B) регулятор клеточного цикла. Различные исследования выявили некоторые физические и регуляторные взаимодействия между белками вируса и факторами хозяина, которые сопоставляются с новыми клеточными путями и которые влияют на репликацию вируса гриппа. Например, удаление компонентов пути WNT увеличивает вирусную репликацию и снижает продукцию интерферона (ИНФ), указывает что этот путь регулирует инфицирование вирусом гриппа посредством все еще неизвестных механизмов. Кроме того, два независимых исследования сообщили, что ИФН-индуцированный трансмембранный протеин 3 (IFITM3) ограничивает раннюю стадию репликации вируса гриппа. Дополнительные исследования, для изучения штамм-специфичных эффектов этих факторов хозяина не только помогут нащему пониманию взаимодействия вирус гриппа-хозяин, но, так же, возможно приведут к развитию новых, повсеместно распространенных противовирусных подходов. Ингибирование определенных факторов хозяина (не затрагивая хозяин-специфичных функций) может быть успешно использовано в качестве фармакологического вмешательства в борьбу с вирусами гриппа и может свести к минимуму развитие резистентных штаммов вируса.

Новые представления о патогенезе вируса гриппа

Генетические манипуляции с вирусом гриппа позволили идентифицировать некоторые вирусные маркеры, которые связаны с вирулентностью и патогенезом (таблица 1). В частности, реконструкция вируса гриппа H1N1 ответственного за пандемию гриппа в Испании в 1918 года и исследования вирусов гриппа HPAI H5N1 четко установили сложность и мультигенную характеристику патогенеза вируса гриппа. Кроме того, системы моделей на животных разработаны и широко используются для объяснения многих взаимодействий вирус-хозяин и факторов хозяина, которые способствуют патогенезу (рис. 4). Точно так же, пандемия H1N1 в 2009 году расширила наше понимание основных факторов риска и молекулярных механизмов, которые приводят к тяжелым заболеваниям у людей.

Конституциональный иммунитет и патогенез. Как уже говорилось выше, антигенные свойства ГА гриппа являются главной детерминантой патогенеза. Главной беспокойство об антигенной изменчивости – то, что она может создать пандемический человеческий вирус относящийся к подтипу ГА, к которой человеческая популяция интактна. Тем не менее, новая концепция пандемии H1N1 в 2009 годы заключается в том, что изменения подтипа ГА не достаточны для генерации вирусной пандемии у человека, тогда как младшие члены популяции иммунологически интактны и, таким образом, восприимчивы к штаммам, действию которых постоянно подвергалось старшее поколение и обрело защиту от них (рис. 2). Во время пандемии H1N1 в 1918 году, вирус H1N1 создал независимые линии у людей и свиней. Постоянный антигенный дрейф вирусов H1N1 у людей привел к возникновению сезонных вирусов H1N1, которые значительно отличаются по антигенам от оригинального, родительского вируса 1918 года. Тем не менее, ГА свиного вируса H1N1, который сформировался во время пандемии 1918 года, стал производным для нового пандемического вируса H1N1, не подвергаясь обширному дрейфу и таким образом поддерживался «антигенно замороженным» в свиньях. Это может быть связано с короткой продолжительностью жизни домашних свиней, которые не подвергаются нескольким заражениям вирусом гриппа в течении жизни и, следовательно, не находятся под давлением главной гуморальной селекции, стимулирующей антигенный дрейф. Кроме того, давление хозяин-специфической иммунной селекции может приводить к антигенному дрейфу у свиней в сайтах отличных от тех, которые важны для иммуногенности у людей. Оба процесса могут привести к «антигенной заморозке» ГА. Таким образом, учитывая правильные условия (к примеру, зоонозные передачи большой иммунологически интактной человеческой популяции), избыток встреч с вирусом, который может циркулировать некоторое время в свиньях, приводя к возникновению нового пандемического человеческого вируса, содержащего ГА из ранее циркулирующего подтипа.

Ранние эпидемиологические данные, собранные во время пандемии 2009 года, показали, что молодые (65 лет). В сыворотках пожилых людей были обнаружены перекрестно-реагирующие антитела к новому штамму, что наводит на размышления о предыдущем воздействии антигенно подобных вирусов. Примечательно, что иммунизация мышей вирусоподобными частицами H1N1 1918 года, вирусами H1N1 человека, которые циркулировали до 1947 или классическими свиными вирусами H1N1 привела к выработке перекрестно-реагирующих антител и присвоила защиту от вируса H1N1 2009 года, что демонстрирует тесное антигенное сходство этих вирусов. Самое высокое антигенное сходство между новым и старым пандемическими вирусами 2009 и 1918гг, которые имеют высокое сходство в антигенных сайтах (названных Sa, Sb, Ca1, Ca2 и Cb ) шаровидной головки белка ГА, в частности, на сайте Sa82. Вакцинация людей новым вакцинным штаммом H1N1 2009 года вызывает значительный уровень перекрестных антител против вируса H1N1 1918 года, что подтверждает их антигенное сходство, и лечение мышей человеческой сывороткой, которая была положительна по этим антителам, защищала мышей зараженных вирусом H1N1 1918 года от летального исхода. Безграничное глобальное распространение вируса H1N1 в 2009 году, которое привело к миллионам спонтанных инфекций и широкому распространению иммунизации вакцинным штаммом H1N1 2009 года показывают, что большая часть мирового населения теперь имеет антитела, которые перекрестны к вирусу 1918 года, что является непредвиденным преимуществом текущего вакцинного штамма. В противоположность этому, вакцины против сезонных вирусов гриппа H1N1 имеют низкую перекрестную реактивность к вирусу 1918 года. Это связано с накоплением мутаций в антигенных сайтах ГА в течении антигенного дрейфа и приобретением гликозилированных сайтов в белке шаровидной головки, которая может защищать антигенно соответствующие области; в целом, эти изменения приводят к радикальным антигенным различиям между сезонными штаммами и пандемическими вирусами 1918 и 2009 годов. Таким образом, молодые люди, которые были подвержены только современным сезонным вирусам H1N1 иммунологически интактны пандемическому вирусу H1N1 2009 года, что частично объясняет более высокую частоту развития у них тяжелой болезни, вызванной пандемическим вирусом 2009 года.

Вирусные детерминанты патогенеза

Последовательность на участке рестрикции ГА, является основным фактором, определяющим тяжесть заболевания. Участок рестрикции ГА самых низкопатогенных штаммов вируса гриппа содержит одиночную аминокислоту аргинин, которая распознается специфическими трипсиноподобными внеклеточными протеазами (например, сериновые протеазы, такие как трансмембранная протеаза человека серин 2 (TMPRSS2) и трипсиноподобные протеазы эпителия дыхательных путей человека), которые представлены в организме хозяина только в слизистой оболочке кишечника и дыхательных путей. Тем не менее, белки ГА вирусов Н5 и Н7 HPAI характеризуются наличием многоосновного участка рестрикции, который расщепляется встречающимися повсюду внутриклеточными протеазами, что находятся в различных органах, такими как субтилизин-подобные протеазы фурин и конвертаза пропротеина субтилизин-кексин типа 6. Это может приводить к системной инфекции и повышать вирулентность, особенно у птиц и мелких млекопитающих. У людей, заражение вирусом HPAI H5N1 так же характеризуется наличием вирусной РНК вне респираторной ткани и высокой летальностью в результате полиорганной недостаточности. Тем не менее, не смотря на то, что пандемический вирус H1N1 лишен многоосновного участка рестрикции ГА, результатами инфицирования этим вирусом животных моделей были высокий уровень вирусной репликации и индукция провоспалительных цитокинов, которые приводят к тяжелой болезни. Рекомбинантные вирусы экспрессирующие только нуклеопротеин (НП) и белки РНК-зависимой РНК-полимеразы РВ1, РВ2 и РА вируса 1918 года, вместе с сезонной ГА, продемонстрировали эффективную репликацию в ВДП и НДП хорьков. Кроме того, белки ГА, НА и РВ1 вируса 1918 года так же являются критическими факторами, определяющими вирулентность у мышей. Недавно определенным фактором вирулентности является белок PB1‑F2, который локализуется в митохондриях инфицированных клеток, индуцирует растворение митохондриальной мембраны и приводит к апоптозу. Пандемический вирус 1918 года необычен тем, что он содержит остаток S66 в PB1‑F2, который представлен только в различных изолятах вирусов HPAI H5N1. Наиболее распространенный остаток, найденный в этой позиции в PB1‑F2 других штаммов – это N, и замена S66N резко снижает вирулентность вируса 1918 года и других вирусов, которые содержат сегмент HPAI PB1. Также PB1‑F2 способствует возникновению и повышает патогенез вторичной инфекционной пневмонии. Совсем недавно было обнаружено, что PB1‑F2 взаимодействует с вирусным белком ингибируя интерфероновый ответ хозяина. Тем не менее, в некоторых вирусах, в частности в свином и современном человеческом изолятах H1N1 (включая пандемический штамм H1N1 2009 года), стоп кодоны в PB1‑F2 приводят к экспрессии процессированного белка, но восстановление кодирующей емкости PB1‑F2 только минимально влияет на вирулентность, вероятно из-за дополнительных требований последовательности в PB1‑F2 (см. обзор 120). Другой детерминантой вирулентности вируса гриппа является многофункциональный белок NS1 (см. обзор 121), который является антагонистом противовирусной ИФН-опосредованной реакции хозяина и модулятором приобретенного иммунного ответа, и может ингибировать всеобщую экспрессию генов хозяина посредством его взаимодействия с дробящимся ядерным белком и субъединицей полиаденилированного фактора специфичности размером 30 кДа (CPSF30, так же известный как CPSF4). NS1, вероятно, вносит вклад в дизрегуляцию цитокинов, которая наблюдалась у макак, зараженных вирусом 1918 года и людей, которые поддались вирусной инфекции HPAI H5N1.  Остаток Е92 вирусного NS1 вируса HPAI H5N1 так же был вовлечен в вирулентность. Белок NS1 пандемического штамма H1N1 2009 года содержит оба вида мутаций, ликвидирующую CPSF30-связывающие свойства и 11 делеций аминокислот карбоксильного конца, и, следовательно, ему не хватает PDZ-связывающего домена, который ранее был замешан в вирулентности. Неожиданно, но когда эти функции появлялись вновь, они не оказывали серьезного влияния на репликацию, патогенез или передачу пандемического вируса 2009 года, предполагается, что некоторые функции NS1 не являются необходимыми, для успешного заражения человека.

Детерминанты патогенеза хозяина

У людей, вирусы HPAI могут приводить к повышению плазменного уровня ИФНγ-индуцированного белка до 10 кДа (IP10, так же известный, как CXCL10), моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 (MCP1, так же известный как CCL2), интерлейкина-8 (ИЛ-8), ИЛ-6, ИЛ-10 и других провоспалительных цитокинов, которые коррелируют с повышением вирусной нагрузки в глотке и увеличением частоты смертельных случаев вирусной пневмонии (см. обзор 125). Модели млекопитающих инфицированных вирусами H1N1 1918 года и HPAI H5N1 продемонстрировали высокую и скорую активацию генов иммунного ответа хозяина. Заражение вирусом H1N1 1918 года, в сравнении с инфицированием современным штаммом H1N1, ассоциировано с тяжелой легочной патологией. Эти модели заражения так же показывают индукцию инфильтрации макрофагами и нейтрофилами для обоих штаммов (вирусов HPAI H5N1 и H1N1 1918 года), результатом которой являются острое воспаление легких и дерегуляция противовирусных ответов, недостаточных для защиты и, возможно, вносят вклад в патогенез. Тяжесть заболевания, в результате заражения вирусом 1918 года коррелирует с устойчивой патологией, развивающейся вследствие активации воспаления и гибели генов клетки. Аналогично, повышенная и длительная транскрипция 1 типа ИФН, воспаление и индукция врожденного иммунитета видны во время заражения вирусом HPAI H5N1, результатом которого являются апоптоз дендритных клеток и тяжелая патология легких. Кроме того, заражение вирусом гриппа мышей с дефицитом ИЛ-15 (см. 133), ИЛ-17 (см. 134) или сигнальных рецепторов 2 СС-хемокинов (CCR2) и мышей, которые испытывают недостаток фактора некроза опухоли (TNF) и рецепторов к ИЛ-1 приводит к увеличению выживаемости и/или задержке летальности по сравнению с наблюдаемыми у инфицированных мышей дикого типа, в следствие снижения уровня лейкоцитарной, нейтрофильной или макрофагальной инфильтрации. Инфекции у ИЛ-10-отключенных мышей могут вызывать увеличение продукции антител в легких в сравнении с уровнем у инфицированных мышей дикого типа, что приводит к снижению титра вируса и увеличению выживаемости. Тем не менее, различные исследования показали, что CD8+ эффекторные Т-клетки, производя ИЛ-10, могут контролировать воспаление легких и травмы, которые индуцируются во время острого заражения вирусом гриппа. Таким образом, для определения роли ИЛ-10, необходимо дальнейшее исследование, в частности, в контексте высоко вирулентных штаммов вируса гриппа. Кроме того, мыши которые дефицитны по TNF, ИЛ-6 или рецептору СС-хемокина 2 (CCL2) поддаются заражению вирусом HPAI H5N1 так же, как и мыши дикого типа, указывая, что хотя острая иммунная реакция хозяина может способствовать патогенезу, эллиминация некоторых про-воспалительных сигналов не предотвращает тяжесть заболевания. Новый инструмент, направленный на выяснение кинетики и клеточного тропизма при заражении вирусом гриппа in vivo, обеспечивает развитие способных к репликации флуоресцентно меченных вирусов гриппа А. Этот инструмент показал, что клетки натуральных киллеров, В-клетки и антиген-представляющие клетки так же восприимчивы к инфекции, в дополнение к эпителиальным клеткам. Такие системы моделей позволяют исследовать в дальнейшем специфические клетки хозяина, которые вносят вклад в патогенез и восстановление от болезни.

Во время пандемии H1N1 2009 года, у подгруппы индивидов развивалась быстрая и тяжелая вирусная пневмония, которая часто ассоциировалась с недостаточностью других органов и приводила к значительным ухудшениям, лежащим в основе астмы или хронической обструктивной болезни дыхательных путей. Наивысшие риски тяжелой или смертельной болезни были обнаружены у беременных женщин (особенно в третьем триместре беременности), детей младше двух лет и людей с хроническими заболеваниями легких, включая астму. Ожирение и сахарных диабет были снова установлены, как факторы риска тяжести инфекции пандемическим вирусом H1N1 2009 года. У некоторых здоровых людей так же наблюдалась тяжелое инфицирование этим вирусом. Тем не менее, основная причина тяжести до сих пор неизвестна, внимательное наблюдение за клиническим течением и быстрое ведение лиц с тяжелой болезнью остаются основными подходами для снижения летальности. Интересно, что недавнее исследование сообщило о высокой корреляции для иммунокомплексно-опосредованного заболевания и тяжести симптомов у взрослых, после заражения вирусом H1N1 2009 года. Тяжесть заболевания была ассоциирована с высоким уровнем низко-авидных, не-протективных антител и иммунокомплекс-опосредованного комплимента, активирующегося в дыхательных путях инфицированных взрослых, раскрывая новейший механизм, который может объяснить повышенную тяжесть заболевания, наблюдавшуюся у индивидов среднего возраста во время пандемии H1N1 2009 года. Дополнительные исследования, расширяющие эти наблюдения на животных моделях стали бы важным шагом на пути к пониманию тяжести заболевания, вызванного пандемическими вирусами гриппа А.

Что ожидает в будущем?

Штамм H1N1 2009 года кардинально изменил динамику циркуляции предыдущих сезонных штаммов вируса гриппа (с момента появления пандемического, сезонные H1N1 почти не обнаруживались по всему миру). Иммунное давление отбора вероятно станет причиной того, что вирус H1N1 подвергнется изменению антигенных характеристик (то есть, произойдет антигенный дрейф). Воздействие современных сезонных вирусов, иммунизация текущими вакцинными штаммами и уже существующий иммунитет к прошлым вирусам H1N1 вместе сформировали сложный спектр иммунитета в популяции и это, вероятно, способствует отбору ранее невиданных вариантов дрейфа, отражающих пластичность антигенной эволюции белка ГА вируса гриппа. Высокая пропускная способность полногеномного секвенирования, для оригинальных клинических изолятов позволит систематически наблюдать вирусы гриппа человека в реальном времени, чтобы установить варианты дрейфа и генетические изменения, которые могут быть эпидемиологически востребованы.

Дополнительный акцент так же должен быть поставлен на изучении вирусов гриппа от людей и от диких и домашних животных в географических регионах, которые в настоящее время скудно представлены или не представлены в геномных базах данных (к примеру латинская Америка и Африка). Непрерывное и усиленное наблюдение за дикими хозяевами, которые переносят вирусы гриппа не только позволяет обнаружить новые штаммы, но также способствует нашему пониманию экологии вируса гриппа (путем наложения на карту мира «горячих точек» вируса гриппа А), видов, которые переносят эти вирусы и степени, в которой природная миграция птиц и/или локализация сообществ птиц модулирует генерацию рекомбинантных вирусов. Дополнительное вирусное секвенирование так же может содействовать в уточнении современных моделей эволюции вируса гриппа, усовершенствовать наше умение оценивать лежащую в основе молекулярную базу вирулентности и помочь в разработке усиленного наблюдения по всему миру, более эффективного в долгосрочной перспективе.

В настоящее время, для лечения инфекции вирусом гриппа человека используется два семейства противовирусных препаратов. Оцельтамивир(Тамифлю; Roche) и Занамавир (Реленза; GlaxoSmithKline) ингибируют нейраминидазную активность белка НА, таким образом блокируя высвобождение вновь сформированных вирионов из зараженных клеток. Адамантаны (амантадин и римантадин) ингибируют способность к обмену H+ вирусного белка М2 ионного канала необходимую для снижения pH внутри вируса, шага, который необходим для раздевания вируса в момент вступления в клетку хозяина.  Хотя эти противовирусные терапии являются эффективными против текущих штаммов вируса гриппа, их использование может привести к селекции устойчивых вирусов и резистентных штаммов, встречающихся в природе (таблица 1). Это подчеркивает большую необходимость в дополнительных терапевтических подходах широкого спектра. Препараты, нацеленные на различные вирусы или хозяина и различные стадии репликации вируса гриппа будут представлять внушительные средства борьбы с инфекцией путем нескольких подходов и минимизируют развитие резистентных вирусов.

Комплексная динамика вирусов гриппа беспрерывно испытывает барьеры видов-хозяев и, потому, возникновение новых вирулентных штаммов вируса у людей постоянно вероятно. Чтобы получить полное представление о механизме, с помощью которого возникают рекомбинантные вирусы, необходимы дальнейшие исследования, для выявления требуемых специфических рецепторов и специфических типов клеток, или типов и сайта (органа), где такое событие может иметь место. Кроме того, выявление молекулярных требований к рекомбинации на уровнях вирусного фактора и факторов хозяина может значительна помочь нам понять, как эти вирусы возникают в природе и, следовательно, должны привести к дополнительным и расширенным противовирусным вмешательствам. Более того, в этом комплексном взаимодействии между хозяином и вирусом гриппа, факторы хозяина играют важную роль в тяжести заболевания и исходе, и исследования, фокусирующиеся на идентификации факторов предрасположенности человека, следовательно, ключ к пониманию детерминант патогенеза вируса гриппа у хозяина. Современные системы модели на животных лишь частично воспроизводят человеческий грипп, так, дополнительно, с большой осторожностью разработаны клинические исследования необходимые для обоснования таких моделей и поиска генетических факторов предрасположенности и полиморфизма, а также лежащих в основе, специфических условий, которые модулируют исход заболевания у людей.