Белковая инженерия

Белок в химическом отношении представляет собой однотипную молекулу, которая является полиаминокислотной цепочкой или полимером. Составлен он из аминокислотных последовательностей 20 типов. Узнав строение белков, люди задались вопросом: можно ли спроектировать абсолютно новые аминокислотные последовательности, чтобы они выполняли нужные человеку функции гораздо лучше, чем обычные белки? Для данной дерзкой идее лучше всего подошло название белковая инженерия.

О такой инженерии стали задумываться ещё в 50-е годы XX столетия. Случилось это сразу же после расшифровки первых белковых аминокислотных последовательностей. Во многих лабораториях мира начали делать попытки дублировать природу и синтезировать химическим путём заданные абсолютно произвольно полиаминокислотные последовательности.

Больше всех в этом преуспел химик Б. Меррифилд. Этому американцу удалось разработать чрезвычайно эффективный метод синтеза полиаминокислотных цепей. За это Меррифилду в 1984 году присудили Нобелевскую премию по химии.

Американец начал синтезировать короткие пептиды, включая гормоны. При этом построил автомат – «химического робота» – в задачу которого входило производит искусственные белки. Робот вызвал сенсацию в научных кругах. Однако скоро выяснилось, что его продукция не может конкурировать с тем, что производит природа.

Робот не мог в точности воспроизводить аминокислотные последовательности, то есть ошибался. Он синтезировал одну цепь с одной последовательностью, а другую уже с чуть-чуть другой. В клетке же все молекулы одного белка идеально похожи друг на друга, то есть их последовательности абсолютно одинаковые.

Была и ещё одна проблема. Даже те молекулы, которые робот синтезировал правильно, не принимали ту пространственную форму, которая необходима для функционирования фермента. Таким образом, попытка подменить природу обычными методами органической химии привела к весьма скромному успеху.

Учёным оставалось учиться у природы, выискивая нужные модификации белков. Тут дело в том, что в природе постоянно идут мутации, ведущие к изменению аминокислотных последовательностей белков.

Если отобрать мутантов с необходимыми свойствами, скажем более эффективно перерабатывающих тот или иной субстрат, то можно выделить из такого мутанта измененный фермент, благодаря которому клетка приобретает новые свойства. Но данный процесс занимает очень большой период времени.

Все изменилось тогда, когда появилась генная инженерия. Благодаря ей, стали создавать искусственные гены с любой последовательностью нуклеотидов. Эти гены встраивали в приготовленные молекулы-векторы и внедряли эти ДНКв бактерии или дрожжи. Там с искусственного гена снималась копия РНК. В результате этого вырабатывался нужный белок. Ошибки в его синтезе исключались. Главное, надо было подобрать нужную последовательность ДНК, а дальше уже ферментная система клетки сама безупречно делала своё дело.

Таким образом, можно заключить, что генная инженерия открыла путь белковой инженерии в самой радикальной форме. К примеру, мы выбрали белок и захотели заменить в нём один аминокислотный остаток на другой.

Прежде чем начать работу по замене, необходимо приготовить ДНК-вектор. Это вирусная или плазмидная ДНК со встроенным в неё геном того белка, который нас интересует. Нужно также знать нуклеотидную последовательность гена и аминокислотную последовательность кодируемого белка. Последняя определяется из первой при помощи таблицы генетического кода.

С помощью таблицы также легко установить, какие минимальные изменения следует произвести в составе гена, чтобы он начал кодировать не исходный, а изменённый по нашему желанию белок. Допустим, в середине гена нужно гуанин заменить на тимин.

Из-за такой мелочи не нужно заново синтезировать весь ген. Синтезируется лишь небольшой фрагмент нуклеотидов, комплементарный участку, в середине которого располагается выбранный для замены нуклеотид гуанин.

Полученный фрагмент смешиваем с ДНК-вектором (кольцевая ДНК), в которой содержится нужный нам ген. Кольцо ДНК и синтезированный фрагмент создают участок уотсон-криковской двойной спирали. В нём центральная пара «выпихивается» из двойной спирали, так как она образована взаимно некомплементарными нуклеотидами.

Добавляем в раствор четыре дНТФ и ДНК-полимеразу. Последняя, используя налипший на одиночное кольцо фрагмент, достраивает его до полного кольца в полном соответствии с принципом комплементарности.

В результате у нас получается почти нормальная векторная ДНК. Её можно ввести в дрожжевую или бактериальную клетку для размножения. Единственное, эта ДНК отличается от исходного вектора некомплементарной парой. Иными словами, спираль ДНК-вектора совершенна не полностью.

При первом же акте удвоения полученного вектора вместе с несущей его бактерией, каждая из дочерних молекул ДНК станет совершенной двойной спиралью на всём своём протяжении. Однако одна из дочерних молекул несёт в себе исходную нуклеотидную пару, а у другой в этом месте находится мутантный вектор, на основе которого и получается интересующий нас мутантный белок.

Таким образом, белковая инженерия создаёт смесь клеток. Одни из них несут исходный вектор с немутантным геном, а другие клетки несут мутантный ген. Остаётся отобрать из этой смеси именно те клетки, в которых находится мутантный ген.

Вячеслав Маркин